實驗原理

細胞克隆形成實驗是用來(lai)檢測細胞增殖能力、侵襲性(xing)、對殺傷因素敏感性(xing)等項目的重要(yao)技(ji)術方法。

當單個細(xi)(xi)胞(bao)在體(ti)外(wai)增(zeng)殖6代以上，其后代所(suo)組成(cheng)(cheng)的細(xi)(xi)胞(bao)群體(ti)，成(cheng)(cheng)為集落或(huo)克(ke)(ke)隆。其中(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)克(ke)(ke)隆形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)率即(ji)細(xi)(xi)胞(bao)接(jie)種存活率，表(biao)示接(jie)種細(xi)(xi)胞(bao)后貼壁的細(xi)(xi)胞(bao)成(cheng)(cheng)活并形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)克(ke)(ke)隆的數量。

貼壁(bi)后的(de)細(xi)胞(bao)(bao)不一定(ding)每個都能增殖和(he)形成克隆，而形成克隆的(de)細(xi)胞(bao)(bao)必(bi)為(wei)貼壁(bi)和(he)有(you)增殖活力(li)的(de)細(xi)胞(bao)(bao)。

克隆形成率(lv)反映細胞群體依賴性和增(zeng)殖(zhi)能(neng)力兩個重要性狀。

克隆形成的(de)目的(de)

1）通過(guo)對細胞處理后(hou)(hou)在細胞培(pei)養(yang)板上的克隆(long)形成能力(li)(li)來提示(shi)處理后(hou)(hou)細胞的增殖能力(li)(li)。

2）評價(jia)不同殺傷因素(藥(yao)物、基因等)對腫(zhong)瘤細胞增(zeng)殖(zhi)能(neng)力或群體(ti)依(yi)賴性的敏(min)感性;

3）評(ping)價細(xi)胞(bao)在(zai)體(ti)內(nei)(nei)成瘤(liu)(liu)性，癌細(xi)胞(bao)不一定都可以在(zai)體(ti)內(nei)(nei)成瘤(liu)(liu)，但(dan)若體(ti)外克隆能力(li)越強(qiang)，即(ji)表(biao)明體(ti)內(nei)(nei)成瘤(liu)(liu)性越強(qiang)，算(suan)是一種(zhong)模擬體(ti)內(nei)(nei)成瘤(liu)(liu)的(de)體(ti)外實驗(yan)。

克隆形(xing)成(cheng)的(de)分(fen)類

克(ke)隆形成依據采用的(de)培養(yang)介質的(de)不同(tong)，分為(wei)平板克(ke)隆和軟瓊脂克(ke)隆兩類(lei)。

1. 平板克隆形成（Colony formation）：細(xi)胞(bao)培養在培養基(ji)中，應(ying)用于貼壁(bi)的細(xi)胞(bao)。

2. 軟瓊脂克隆形成（soft agar colony formation）：細(xi)胞被瓊脂糖掛起來，主要應用于懸(xuan)浮的腫瘤細(xi)胞和(he)轉化(hua)細(xi)胞系。

下面我(wo)們就具體看一下這2種實(shi)驗(yan)技(ji)術的(de)具體操作(zuo)。

01平板克隆實驗(yan)過程(cheng)

所需材料

• 基礎培養基（根據細胞選擇適用種(zhong)類）

• 胎牛血清

• 胰蛋白酶

• PBS

• 青霉素(su)-鏈霉素(su)溶(rong)液（100X）

• 多聚甲醛固定

• 結(jie)晶紫(zi)染液

• Giemsa染(ran)液

實驗步驟

一、6孔板

1.將處于對數(shu)生(sheng)長期的細胞胰酶消化后(hou)，全部培(pei)養基（基礎培(pei)養基+10%胎牛血清）重懸(xuan)成細胞懸(xuan)液，并計(ji)數(shu)；

2.細(xi)胞接種(zhong)：于6孔板(ban)培(pei)養板(ban)中各實驗組接種(zhong)400-1,000個細(xi)胞/孔（根據細(xi)胞生(sheng)長情況確定，一般為700個細(xi)胞/孔）;

3.繼續培養到14天或絕大(da)多數單個克隆中細胞(bao)數大(da)于(yu)50為(wei)止，中途每隔3天進(jin)行換(huan)液并觀察細胞(bao)狀態；

4.克(ke)隆完成后(hou)，在顯微鏡(jing)下(xia)對細(xi)胞進行拍照，然后(hou)PBS洗(xi)滌1次(ci)，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定(ding)30-60 min，PBS洗(xi)滌1次(ci)；

注意事項

1.每隔3天進行換液，在換液時(shi)，緩慢加入(ru)培養基，避(bi)免吹起(qi)細胞。

2.染色完(wan)成后，務必(bi)將(jiang)染液清洗干凈(jing)，不要在(zai)孔中有殘留。

二、平(ping)皿

1. 取(qu)對數生長期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋(dan)白酶(mei)消(xiao)化(hua)并(bing)吹打成單(dan)個細胞，并(bing)把細胞懸浮在全部(bu)培養(yang)基(ji)（基(ji)礎培養(yang)基(ji)+10%胎(tai)牛(niu)血清）中備用。

2. 將細(xi)胞懸液作梯度(du)倍數稀釋，每組5個平行樣。每組細(xi)胞每皿(min)分別(bie)接種100個細(xi)胞于含(han)10ml 37℃預溫培養液的皿(min)中，并輕輕轉動，使細(xi)胞分散均(jun)勻(yun)。

3. 置37℃、5% CO2及飽和濕度的細胞培(pei)養(yang)箱中培(pei)養(yang)2～3周。

4. 當(dang)培(pei)養(yang)皿(min)中出現肉眼可見的(de)克隆(long)時，終(zhong)止培(pei)養(yang)。棄去(qu)上清液，用PBS小心浸洗(xi)2次。

5. 加純(chun)甲(jia)醇(chun)(chun)或1:3醋酸/甲(jia)醇(chun)(chun)5ml，固(gu)定15分鐘。

6. 去(qu)固定液，加適(shi)量(liang)Giemsa應用染色液染10～30分鐘

7. 用流水緩(huan)慢(man)洗去染(ran)色液(ye)，空氣(qi)干燥。

8. 將平皿倒(dao)置并(bing)疊加一張(zhang)帶網格(ge)的透明膠片，用肉眼直接(jie)計(ji)數克(ke)隆，或(huo)在(zai)顯微(wei)鏡（低倍鏡）計(ji)數大(da)于10個(ge)細胞的克(ke)隆數。最后計(ji)算克(ke)隆形成率(lv)。

克(ke)隆形成率=（克(ke)隆數(shu)/接種細(xi)胞數(shu)）×100%

DU145細胞(bao)克隆形(xing)成的圖片（相機左，顯微鏡右）

注意事項

平板克隆形(xing)成(cheng)實(shi)驗方法簡(jian)單，適用于貼壁生長(chang)的細胞(bao)。適宜底物為玻璃的、塑(su)料(liao)瓶(ping)皿。

實驗成功的關(guan)鍵是細胞懸液(ye)的制備和接種(zhong)密度。細胞一定要分散得(de)好，不(bu)能有細胞團(tuan)，接種(zhong)密度不(bu)能過大。

數據分析

顯微鏡下(xia)觀察(cha)陽性(xing)克(ke)(ke)(ke)隆，即(ji)每個(ge)克(ke)(ke)(ke)隆>50個(ge)細(xi)胞(bao)，相機拍照，數(shu)克(ke)(ke)(ke)隆數(shu)（大小約(yue)在0.3-1.0 mm）計算克(ke)(ke)(ke)隆形成率，并統(tong)計克(ke)(ke)(ke)隆大小。

例：如研究(jiu)某個基(ji)因對(dui)細胞增殖的影(ying)響，敲(qiao)低前列腺癌細胞株PC3的TCTN1基(ji)因，顯微鏡下(xia)拍(pai)照（Scale bar=250 μm）和相機拍(pai)照，克隆的大小(xiao)和數量均受到(dao)抑制。

02軟瓊(qiong)脂克(ke)隆形成(cheng)

軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴(lai)性(xing)生(sheng)長實驗Anchorage-independent assay，利用軟瓊脂為培養(yang)介質，使細胞(bao)在懸浮(fu)狀態下生(sheng)長。

某些惡性腫瘤細胞，不僅在貼壁狀態下能增殖，在懸浮狀態下也能增殖，進而通過軟瓊脂中形成克隆的能力反映了惡性程度，可用于細胞分化的基礎研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗等方面。

1. 具體過程：如下(xia)圖所(suo)示   

1. .配制1.2% 和0.7%瓊脂，高壓(ya)滅菌后，維持在42℃中使其(qi)不會凝固；

2. 將1.2% 瓊脂與2×培養(yang)基(ji)混合，鋪(pu)入6孔板作(zuo)為(wei)下層膠，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固；

3. 將制(zhi)備好(hao)的單細胞懸液與0.7%瓊脂充(chong)分(fen)混勻(yun)，加(jia)入6孔(kong)板作為上層膠，每孔(kong)1.5ml。待其凝固后(hou)，再在上面加(jia)入培(pei)養基，每3天更換(huan)一次(ci)；

4. 根據細胞的生長速度(du)培(pei)養2~3周后(hou)顯微鏡下觀察克(ke)(ke)隆(long)大(da)小，與平(ping)板克(ke)(ke)隆(long)一樣，每(mei)個克(ke)(ke)隆(long)>50個細胞(bao)，顯微鏡拍照(zhao)。若拍整個孔(kong)，每(mei)孔(kong)加入200μl氯化硝基四(si)氮唑(zuo)藍（NBT）染色，37°C過夜，拍照(zhao)。

2. 數據(ju)分(fen)析：顯微(wei)鏡或相(xiang)機拍(pai)照，計算克隆形成(cheng)率

例：通過軟(ruan)瓊脂克隆形成實(shi)驗(yan)檢測ME2蛋(dan)白對(dui)神經(jing)膠(jiao)(jiao)質(zhi)瘤細胞生(sheng)長的(de)影響。在神經(jing)膠(jiao)(jiao)質(zhi)瘤細胞GBM8401中將(jiang)ME2蛋(dan)白敲低，形成的(de)克隆數(shu)減少。

注意事項

1.上(shang)層(ceng)軟(ruan)瓊脂使細(xi)胞(bao)分散成單個，下層(ceng)軟(ruan)瓊脂作為支撐防(fang)止(zhi)細(xi)胞(bao)貼附生長。最(zui)后鋪上(shang)一層(ceng)培養(yang)基是為了(le)防(fang)止(zhi)膠干燥(zao)，并給細(xi)胞(bao)補充營養(yang)，如果做藥(yao)物處(chu)理，則在培養(yang)基中(zhong)加(jia)入藥(yao)物。

2.上層膠(jiao)細胞數目根(gen)(gen)據不同的(de)細胞類型(xing)而定。一般(ban)以(yi)5000個細胞/孔作為起始濃(nong)度，根(gen)(gen)據需(xu)要調整(zheng)。

3.瓊脂放入(ru)水浴鍋中維持(chi)在42℃左右。溫(wen)(wen)度過低瓊脂凝固，在做基底時瓊脂凝固過快會(hui)導(dao)致不均一(yi)，溫(wen)(wen)度過高(gao)則(ze)會(hui)將細(xi)胞燙死。此外(wai)，實驗過程中速(su)度要快，防止局部(bu)結塊(kuai)。

結語

2種細胞(bao)克隆方(fang)式，如何選擇？

根據(ju)實驗對(dui)象和目的(de)(de)選(xuan)擇，平(ping)板克隆檢(jian)測(ce)貼壁(bi)腫(zhong)瘤細胞(bao)的(de)(de)增(zeng)殖(zhi)能(neng)力和致瘤性，軟(ruan)瓊脂克隆形成(cheng)實驗除了(le)檢(jian)測(ce)貼壁(bi)細胞(bao)，還能(neng)檢(jian)測(ce)懸浮腫(zhong)瘤細胞(bao)和轉化細胞(bao)系，具有平(ping)板克隆不可(ke)取代的(de)(de)優勢。若只是簡單評價貼壁(bi)細胞(bao)的(de)(de)增(zeng)殖(zhi)能(neng)力和群體依賴(lai)性，則選(xuan)擇平(ping)板克隆即可(ke)。

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