EnGen SpRY Cas9 核酸酶是來自 S. pyogenes的 Cas9 核酸酶的變體，其 PAM 作用結構域內有幾個點突變（1）。與野生型 Cas9 不同，EnGen SpRY Cas9 不受 NGG PAM 的限制，在體外應用中可以在任意三核苷酸序列上游進行雙鏈切割。

EnGen® SpRY Cas9 切(qie)割(ge)靈活性(xing)的(de)(de)(de)演示(shi)。A）pXba 的(de)(de)(de)示(shi)意圖(tu)(tu)，顯示(shi)了限制性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei) BsrGI 識(shi)(shi)別位點(dian)(dian)。矩形(xing)框中包含了 BsrGI 識(shi)(shi)別序(xu)列，紅(hong)色三(san)角形(xing)表(biao)示(shi)切(qie)割(ge)位點(dian)(dian)。B）用于(yu)靶向 pXba 中 BsrGI 位點(dian)(dian)的(de)(de)(de)三(san)個 sgRNA 序(xu)列。EnGen SpRY Cas9 和(he)(he) BsrGI 的(de)(de)(de)切(qie)割(ge)位點(dian)(dian)均(jun)以(yi)紅(hong)色三(san)角指(zhi)示(shi)。SpRY Cas9 非經(jing)典 PAMs 以(yi)黃(huang)色文本表(biao)示(shi)。C）在(zai)(zai) 1X NEBuffer r3.1 中，使用 10 units BsrGI 或 1µM EnGen SpRY Cas9 和(he)(he)上(shang)述三(san)種 sgRNA（濃(nong)度(du)均(jun)為1µM）消化(hua)(hua) 1µg pXba 質(zhi)粒(li)(li)（22563 bp）。所有(you)反應在(zai)(zai) 37°C下(xia)溫(wen)育(yu) 1 小(xiao)時，然(ran)后在(zai)(zai) 80°C下(xia)溫(wen)育(yu) 5 分鐘(zhong)。通(tong)過使用 Agilent gDNA ScreenTape 系統在(zai)(zai) 4200 TapeStation 儀器上(shang)進(jin)行凝膠電泳，以(yi)比較 BsrGI 和(he)(he) SpRY 消化(hua)(hua)后產(chan)物(wu) DNA 條(tiao)帶。針(zhen)對 pXba 質(zhi)粒(li)(li)的(de)(de)(de) BsrGI 位點(dian)(dian)進(jin)行定點(dian)(dian)切(qie)割(ge)， BsrGI 和(he)(he) SpRYCas9 切(qie)割(ge)產(chan)生(sheng)了幾乎(hu)一致(zhi)的(de)(de)(de)條(tiao)帶圖(tu)(tu)譜(pu)。使用濃(nong)度(du)低至 50 nM 的(de)(de)(de) EnGen SpRY Cas9 和(he)(he) sgRNA對 1µg pXba 質(zhi)粒(li)(li)進(jin)行消化(hua)(hua)，結果與濃(nong)度(du) 1 µM 的(de)(de)(de)相似。未酶(mei)切(qie)的(de)(de)(de) pXba 作為對照進(jin)行電泳，但(dan)是環(huan)狀 DNA 在(zai)(zai) gDNA ScreenTape 系統中電泳不(bu)能精確(que)地按大(da)小(xiao)進(jin)行分離。

在 1X NEBuffer™ r3.1 中，使用 50 nM 的 EnGen SpRY Cas9 和 50 nM 的 sgRNA，在37°C下反應 1 小時，將 1 µg pXba（22,563 bp）在 pVII ORF 起始密碼子的下游進行線性化。在繼續 DNA 組裝之前，線性化質粒可以選擇經過柱純化或不純化。按照推薦方案，使用 NEBuilder 高保真 DNA 組裝試劑盒將編碼核定位信號（NLS）標簽的寡核苷酸插入到pVII中。通過轉化后生長的克隆數量，可以定性評估在 EnGen SpRY Cas9 消化質粒后，有多少轉化子來自未消化的質粒。雖然不是必需的，但在組裝前對線性化的 pXba 質粒進行純化可以減少背景菌落百分比。