將(jiang)克隆化基因插入合適載體后導入大腸桿(gan)(gan)菌用(yong)(yong)于表(biao)達(da)大量(liang)蛋白質的(de)方法(fa)一般(ban)稱為原核表(biao)達(da)。這種方法(fa)在蛋白純化、定位及功能分(fen)析等方面都(dou)有(you)應用(yong)(yong)。大腸桿(gan)(gan)菌用(yong)(yong)于表(biao)達(da)重組(zu)蛋白有(you)以(yi)下特點：

易于生(sheng)長和控制；用于細菌培(pei)養的(de)(de)材(cai)料不及(ji)(ji)哺乳動物細胞(bao)系統(tong)的(de)(de)材(cai)料昂貴；有各種各樣的(de)(de)大(da)腸桿菌菌株及(ji)(ji)與之(zhi)匹(pi)配的(de)(de)具各種特(te)性(xing)的(de)(de)質粒可供選(xuan)擇。但(dan)是，在(zai)大(da)腸桿菌中表(biao)(biao)達的(de)(de)蛋白由于缺(que)少(shao)修飾和糖基(ji)化(hua)(hua)、磷酸化(hua)(hua)等翻譯后加工，常(chang)形成包涵體而影響表(biao)(biao)達蛋白的(de)(de)生(sheng)物學活性(xing)及(ji)(ji)構象。

表達載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達載體通常為質粒，典型的表達載體應具有以下幾種元件：

（1）選(xuan)擇標志的編(bian)碼序列(lie)；

（2）可控(kong)轉錄(lu)的啟動(dong)子；

（3）轉錄調(diao)控序(xu)列(轉錄終止子，核糖體結(jie)合(he)位點)；

（4）一個多限制酶(mei)切位點接頭；

（5）宿主(zhu)體內自(zi)主(zhu)復制的序列。

原核表達一般程序如下：

獲得目(mu)的(de)基因－準(zhun)備(bei)表達(da)載體－將(jiang)目(mu)的(de)基因插入表達(da)載體中（測序驗(yan)證(zheng)）－轉化(hua)表達(da)宿主(zhu)菌－誘導靶(ba)蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)表達(da)－表達(da)蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)分析－擴增、純化(hua)、進一步檢(jian)測

一、試劑準備

1、LB培養基。

2、100mM IPTG（異丙基硫代-β-D^-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH₂O中，0.22μm濾(lv)(lv)膜抽濾(lv)(lv)，-20℃保存。

二、操作步驟

（一）獲得目的基因

1、通過PCR方法：以含目的基(ji)因(yin)的克隆質粒為模板，按基(ji)因(yin)序列設計(ji)一對引物（在上(shang)游和(he)下(xia)游引物分別(bie)引入(ru)不同(tong)的酶切位點），PCR循(xun)環獲得所需基(ji)因(yin)片段。

2、通(tong)過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或(huo)組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄(lu)形成cDNA第yi鏈(lian)，以逆轉錄(lu)產(chan)物為模板進行PCR循環獲得產(chan)物。

（二(er)）構建重組表(biao)達載體

1、載體(ti)酶(mei)(mei)切：將表(biao)達質粒(li)用限制性內切酶(mei)(mei)（同引物的酶(mei)(mei)切位點）進行(xing)雙酶(mei)(mei)切，酶(mei)(mei)切產(chan)物行(xing)瓊脂糖電(dian)泳后，用膠回(hui)收Kit或凍融法回(hui)收載體(ti)大片段。

2、PCR產物(wu)雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載(zai)體。

（三）獲得含重組表達(da)質粒的(de)表達(da)菌種

1、將連接產物轉化大腸桿(gan)菌DH5α，根(gen)據重組載(zai)體的標志（抗Amp或藍白斑(ban)）作(zuo)篩選，挑(tiao)取單斑(ban)，堿裂解法小量(liang)抽(chou)提質(zhi)粒，雙酶切(qie)初步鑒(jian)定。

2、測序驗證目的基因的插入方(fang)向及閱讀(du)框架均正確，進入下步操作。否則應篩選更多(duo)克隆(long)，重復亞克隆(long)或亞克隆(long)至不(bu)同酶切位點。

3、以此重(zhong)組(zu)質粒(li)DNA轉化表(biao)達宿(su)主菌的(de)感受態細胞。

（四）誘導表達

1、挑取含(han)重(zhong)組質粒的菌體單斑至2ml LB（含(han)Amp50μg/ml）中(zhong)37℃過夜培(pei)養。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中，37℃震蕩培養至OD₆₀₀ ≌0.4-1.0（OD600 0.6，大約(yue)需3hr）。

3、取部分液體作(zuo)為未誘(you)導的對照組，余(yu)下的加入IPTG誘(you)導劑至(zhi)終濃度0.4mM作(zuo)為實驗組，兩組繼(ji)續(xu)37℃震蕩培(pei)養3hr。

4、分別取菌體1ml，離心12000g×30s收(shou)獲(huo)沉淀，用100μl 1%SDS重懸(xuan)，混勻(yun)，70℃10min。

5、離心12000g×1min，取上清(qing)作為樣(yang)品，可(ke)做SDS-PAGE等分析。

三、注意事項

1、選擇表(biao)(biao)達載(zai)體時，要根據所(suo)表(biao)(biao)達蛋白的終應用考慮。如為方便(bian)純化，可選擇融合表(biao)(biao)達；如為獲得(de)天然蛋白，可選擇非融合表(biao)(biao)達。

2、融(rong)合(he)表達時在選擇外源(yuan)DNA同(tong)載體分(fen)子連接反應(ying)時，對轉(zhuan)錄和(he)轉(zhuan)譯過程(cheng)中密碼結構的閱讀(du)不(bu)能發(fa)生干擾。